ネコゲノム解析から考える【１】

”家畜”とは何か？　人によって様々な定義がある。野沢謙 • 西田隆雄による名著”家畜と人間”（1,981年、出光科学叢書）では、”家畜（domestic animal）とはその生殖がヒトの管理（control）のもとにある動物である”と冒頭（p.3）で定義している。単に人に飼われているだけでは不十分だということである。これが分子生物学が応用される前の、世界のフィールドを見てきた碩学による家畜の定義である。

ただし家畜の中でもネコの事情は少し異なる。ネコは生殖がヒトによって管理されておらず、他の家畜に比べると一段階前の状態 "semidomestication" にあると思われる。この書によると、ネコは未だに"餌付け”の段階にあるというわけである。これは我々一般人の感じ方とよく一致している。

家畜の属性として種々の性質が列挙できると思われるが、それらはその家畜や品種の特性として代々維持できる。すなわちその家畜の持っているゲノム（あるいはDNA）にその理由が”書いてある”はずである。当然それらは分子生物学的に違いが明らかにされるはずである。

家畜のゲノム研究は、第一に有用遺伝子の同定、次いで家畜化を成立させた遺伝子変化の同定、この二つの疑問に答えるべく行われている。最近のゲノム解析の潮流に乗って、イエネコ（Felis silvestris catus）のゲノム配列が決定された [Montague et al., 2,014]。これを野生ネコ（Felis silvestrisだがcatus以外の亜種）と比較することによって、ネコが ”家畜化domestication” するのに決定的であった遺伝子変化を探ろうというのである。この研究はワシントン大学（セントルイス、通称WashU）を中心とするグループにより行われた。ちなみにWashUはゲノム解析の分野では世界の先端にいる大学の一つである。これらの研究から、分子生物学時代の”家畜の定義”と新たな家畜の作出（”新家畜”）の可能性について考えてみたい。

考古学的証拠（キプロス島の遺跡）から、ネコは少なくとも9,500年前にヒトに飼われていたという。ヒトが農業生産を開始すると同時に飼育が始まっている。貯蔵穀物を食べるネズミなどの害獣退治のために重宝がられのだ。

このネコゲノムの研究で最初に解析に供されたのはアビシニア種のネコで、ゲノムシークエンシングの結果がウシ、トラ、イヌ、およびヒトのゲノム解析の結果と比較が行われた。これによってネコ族そのものの成立の経過を探ろうというのである。その結果、ネコ族のゲノムでは多数の遺伝子の変化が比較的短期間に起こったことが示された。これらの多くは肉食への適応と、狩りの行動に必要な遺伝的変化であった。

さらにネコの家畜化の過程で起こった遺伝子変化を明らかにするために、異なる品種22頭のイエネコのゲノムと２頭の近東の野生ネコ、および２頭の欧州の野生ネコのゲノムとの比較がなされた。その結果、少なくとも13遺伝子に家畜化に伴う変化が見られた。注意すべきことは、ここで”変化”と謂っているのは、遺伝子が明らかに”機能増強”あるいは”機能喪失”しているような、きわめて明確な変化ではない。

家畜化されたネコは正常に発生し、かつ個体としての機能を営めるので、見出された遺伝子の変化はいずれも僅かな機能変化を起こしていると考えられる。したがって、分子遺伝学的にはこれらの変化は”多型 polymorphophism” として認識される。本論文の著者らは、イエネコに特徴的に見られるSNP (single-nucleotide polymorphism)" を持つ遺伝子をリストアップしたのである。

興味を引くのはある種のグルタミン酸受容体 (GRAIA1) の変化である。GRIA1遺伝子のノックアウトマウスは、恐れに対する反応や褒美の餌で促される学習能力が低下するという [Merdith et al., 2,011]。したがって、イエネコではこの遺伝子の機能に何らかの修飾がなされている可能性がある。イエネコに見られたSNPが機能的にどのような意味を持っているかは、現時点では明らかではないが、調べたすべてのイエネコがこのSNPを持っていたことに意義を見出しているのである。

（続く）

　
　

絶滅危惧種の敵は感染症

教科書的な話で申し訳ないが、感染が成立するためには三つの条件が必要である。それは、感染源（病原微生物）、感染経路、それに感受性宿主（ヒトまたは動物）である。もしある地域の集団が、その感染症の流行を過去に経験していないときは（免疫を持っている割合が0％なので）爆発的な流行を引き起こす。宿主集団の感受性が高いというわけである。これが現在西アフリカで起こっていることである。エボラ出血熱ウイルスに対する免疫を持っているヒトの割合は世界的にみても0％なので、この爆発的流行は全世界に拡大する可能性がある。したがって現在は唯一の方法である感染経路の遮断（空港での患者の発見と隔離）に躍起になっているのである。

このような壊滅的な感染症の流行は人類史上繰り返し起こってきたと思われるが、コロンブスの米大陸の“発見”の直後起こったことは比較的明確に記録されている。

カリブ海の多くの島では欧州人によって持ち込まれた天然痘などの病原体により現地人は全滅してしまった。エスパニョーラ島（現在のハイチとドミニカ共和国、北海道より少し小さい）では1,492年には800万人もいた人口が1,535年にはゼロになっている。この記述はダイヤモンドの著書”銃 • 病原菌 • 鉄”の中にある。察するにエスパニョーラ島は大きな人口を養える豊かな島であったに違いない。欧州人との接触後の人口の激減は北米大陸の広い地域で起こったとされる。（この原住民の絶滅における伝染病の重要性を、米国の義務教育で歴史の科目で教えていることは興味深い。米国の教育は州ごとに違うので全ての州で教えているとは限らないが、少なくとも筆者の住むテネシー州では教えている。）

世界的に進行している生物の絶滅は、この危険な”未知との遭遇”を抜きにして論じることはできない。９月21日に当ブログで掲載した”The Sixth Extinction”の中でも記載されているが、中米パナマの名物の蛙（Panamanian golden frog, Atelopus zeteki）があっというまに消滅してしまったという (1)。この原因は、カエルツボカビ（Batrachochytrium dendrobatidis, Bd）という真菌の感染によることがわかっている。このカビのせいで皮膚から電解質がうまく吸収できず、最終的にカエルは心機能の低下をきたすという。Bdは1,980年代後半から猛威をふるい、このために約200種の両生類が絶滅したとされる。最近はアジアに棲息していた別のカビBatrachochytrium salamandrivorans (Bs)が輸入両生類とともに欧州に侵入して、現地の両生類を脅かしている (2)。　

オーストラリアのコアラはクラミジア感染によってその数を減らしている (3)。これに対処するためにワクチンを開発して投与したところ、感染率が低下し、既感染個体については症状の軽減がみられたという。このような取り組みが動物種絶滅を防ぐ（または絶滅を遅らせる）効果があることは明らかであろう。しかし、どの種から保護を始めるのだろうか？　また同じ動物群に新しい感染症が出現したら同じような手法を繰り返す必要があるだろうし。野生動物の保護に一体どの程度の手間と費用をかけるべきであろうか？　コアラのような愛らしい国のシンボルは人々の同意を得やすいだろう。しかし、絶滅危惧種は気の遠くなるような数である。絶滅危惧種の救済のために、他に山積している問題（飢餓、人の感染症、環境問題）のすべてを放置するわけにはゆかない。

ウイルス感染も難しい問題だ。イリオモテヤマネコにとってネコ免疫不全ウイルス（FIV）の感染は脅威である。沖縄の自治体ではFIVが広がるのを防ぐために様々な策を講じている (4)。竹富島では野良猫を捕獲し、すべての飼い猫の登録制度を作った。島嶼部では感染症に対処するのが比較的容易である。感染症ではないが、久米島の農作物害虫のウリミバエの駆除でも同様であった（11月4日記事参照）。

近年のように人や物資が大規模に動く状況では野生動物の未知の感染症との遭遇は避けることができない。生物多様性が保たれてきた理由の一つは様々な種が地域的に隔離されてきたために、それら地域種の接触する病原体の種類がかなり限定されていたということがあると思う
。

（地理的隔離が崩れつつあることの重要性は違った角度、すなわち近縁種との交雑という面からも論じられるべきだと思うが、長くなるので別の機会にしたい。）

1. http://us.macmillan.com/thesixthextinction-1/

2. http://www.sciencemag.org/content/346/6209/530.summary

3. http://news.discovery.com/animals/koala-chlamydia-vaccine-successful-in-early-tests-141029.htm

4. http://ryukyushimpo.jp/news/storyid-133305-storytopic-1.html

”虫を放して虫を滅ぼす”【３】

RIDL法の開発：トランスジェニックハエ

前回（11月4日）紹介したように、不妊虫放飼法（The Sterile Insect Technique, SIT）が沖縄の蠅の駆除においては大きな威力を発揮することがわかった。これは他の地域の他の蠅についても同様であった。この方法の普及によって、主に温暖な地域の農業の被害が一部ではあるが軽減されたのである。

一方、多くのヒト感染症の媒介昆虫である蚊についてはSITは適さないことがわかっている。それは次のような理由による。まず、蚊の成虫は傷みやすいので大量飼育、放射線照射、運搬による損耗率が高いこと。照射によって繁殖能力のみならず、全身状態の劣化も引き起こすので、野外での交尾行動が低下すること。すなわち放射線の生殖細胞に対する選択毒性が蚊では出にくいのである。

さらには、放飼にあたって雌雄分別をしなければ、吸血する雌成虫を増やしてしまうので結果として感染症を媒介する環境中の個体数を増やしてしまうことになる。これらはいずれも大きな問題である。ハエとカは昆虫の中ではわりと近縁で、この両者は“わずか1億6,000年前“に分岐したらしいが [Misof et al.,2,014]、現実には相当違った生き物である。

英国のLuke Alpheyは、古典的なSITにかわるRelease of Insects carrying a Dominant Lethal (RIDL)法を考案し、その応用可能性をショウジョウバエ（fruit fly, Drosophila melanogaster）を用いて確認する一連の実験を実施した。これは2,000年のScienceに発表されている [Thomas et al., 2,000]。彼らは雌に特異的に発現する遺伝子のプロモーターとテトラサイクリン（Tc）依存的に発現が抑制されるしくみを組み合わせることで、雌の蠅のみが致死に至る仕組みを作り上げた。Tcの有無で遺伝子発現を制御する手法は哺乳動物の培養細胞や、トランスジェニック動物で用いられているものと本質的には違わない。

まず転写活性化タンパクにTc反応性ドメインを融合したタンパク（tTa）のcDNAを雌特異的遺伝子のプロモーターの下流に挿入したものを作成した。さらに毒性を発揮する遺伝子（Dominant Female-specific Lethal gene (DFL)）産物をtTa誘導性プロモーター（tRE）の下流に組み込んだものを作成した。この組み合わせでは、TcがあるとtTaがtReに結合できないので発現は抑制され、Tcがないと発現がおこる（Tet-OFFシステム）。これら２種類のプラスミド、各々を染色体上に組み込んだトランスジェニックハエを別々に作るわけである。

雌特異的に発現するプロモーターには ヴィテロジェニン（vitellogenin）（卵黄タンパク前駆体）等がある。このようなハエはTcを餌に入れるとDFL産物タンパクはハエの体内で産生されないので、実験室（工場）内では何ら異常をおこすことなく蠅を飼えるのである。これはTet-OFFシステムのトランスジェニックマウスを、Tcを加えた水を飲ませて維持するのと同様である。

実際に最初に使用したDFLはRas64BV12である。ヒト、マウスのRasV12は活性化癌遺伝子として有名である。（このシステムはヒト、マウスの癌遺伝子研究の成果の援用であると思われるが、筆者はハエにおける癌遺伝子研究に通暁しているわけではないので詳細を述べることは控えたい。哺乳動物と同様に、活性型Rasを正常細胞に強制発現させると細胞は死滅するらしい。）

tTaを脂肪体特異的プロモーター（Yp3 fat-body enhancer）に繋いだプラスミドと、tRe-Ras64BV12プラスミドを用いて各々別々にホモ接合ハエを作成する。これらのハエは当然何ら異常を示すわけではない。これらのハエを交配して二重ヘテロ接合体のハエを作り、Tcを入れない餌で飼育したところ、雄は生育したが、雌の幼虫も蛹もすべて生育しなかった。一方、Tc存在下では雌は生育した。これら二つのプラスミドを同じ染色体に乗せたトランスジェニックハエも作成したが、同様にTc依存的に雌だけの致死を得ることができた。（ショウジョウバエの染色体は遺伝学で習う通り４対しかないので、同一染色体上にトランスジーンを乗せることは比較的容易である。）

これらの実験結果から実際の蚊の駆除のモデルを提出している。（この段階では未だショウジョウバエの実験室内モデル実験が終わっただけであるが、このあたりは大胆である。）二つのプラスミドを同じ染色体上に持つトランスジェニックハエのホモ接合体を作り、昆虫工場でTc入りの餌で大量に増やす。孵化した段階でTcを除いた餌に換えると、成虫になるのは雄だけである。これら雄を野外に放出するすると野生の雌と交尾する。このとき産まれる卵（仮にF1と呼ぶ）は100％トランスジェニックのヘテロ接合体である。したがって、野外のTcのない環境では雄しか成虫になれない。これらの次世代（F２）の雌は致死、雄は半分しかトランスジーンを持っていないので、次の世代（F３）にはかなりの割合の雌が成虫になってしまう。しかし、世代ごとに十分な数のトランスジェニック雄ハエを放出すれば理論的には数世代で確実に野外のハエは全滅させることができる。実際Alpheyらはハエの減衰率の数学モデルを記載している [Thomas et al., 2,000]。

　このアイデアを基に、Alpheyは2,007年にベンチャー企業（Oxitec Inc.）を設立し、ネッタイシマカのLMOを用いたヒト感染症（デング熱）の媒介昆虫の駆除の実現に向けて動き出すことになる。 

(続く）

横紋筋肉腫の細胞起源の謎

横紋筋肉腫 Rhabdomyosarocoma（RMS）の話である。

この腫瘍は発生頻度は高くないものの（米国では約350例/年）、予後の悪い小児腫瘍として知られている。この腫瘍には組織学的特徴から二つのグループがあり、一つは胞巣型（Alverolar Rhabdomyosarcoma, ARMS, 35%）もう一つは胎児型（Embryonal Rhabdomyosarcoma, ERMS, 65%）である。RMSの名称の由来は組織所見と横紋筋の発生を司る遺伝子群（MyoD1, myogenin等）が発現しているからである。概してARMのほうが悪性である。

ARMSとERMSとは上のような共通した性質をもつが、これらは異なる腫瘍であると考えられている。最近のゲノム配列決定の結果、ゲノム不安定性においてこれら二つの型は著しく異なっているとこが判明した（尤もこれは以前から核型等から予想されていたことではあるが）。ARMSではPAX3/FOXO1やPAX7/FOXO1などの特徴的な相互転座が見られる。これに対して、ERMSでは特徴的な相互転座はなく、核型はより複雑である。実際両者のゲノム変異の率には大きな差があり、ARMS（転座＋）では6.4 (per cell)、ERMS（転座−）では17.8である [Shern et al., 2014]。

注目するべきは、ARMSではPAX遺伝子の相互転座以外にはこれといった変異は認められず、転座タンパクの生成のみで腫瘍発生が説明できる。一方ERMSでは、かなり広範な遺伝子の変異がみられることから、何らかの原因でゲノム不安定性が生じた結果、患者ごとに異なるdriver変異を獲得したものと解釈される。この両者の違いは、ゲノム異常の少ない小児腫瘍型（ARMS）と、異常の多い成人腫瘍型（ERMS）ということができる。

横紋筋肉腫の起源であるが、その発生部位が横紋筋とは異なる解剖的部位であることから、横紋筋の前駆細胞とは異なる可能性が議論されてきた。この点で、Hatleyらの仕事は興味深い (Hatley et al., 2012)。著者のうちの一人（Graff）は脂肪組織の発生を解析することを目的として、aP2遺伝子プロモーター依存的なSmo^M2の発現が起こるマウスを作成した。その結果、100%のマウスにERMSが生じた。Graffは発癌には興味がなかったから、Hatleyがこのマウスを引き継いでその後の解析したのである。

この実験結果からから、少なくともマウスでは脂肪細胞adipocyteがERMSの（少なくと一つの）母細胞であることが示された。しかしながら、診断可能なマウスの腫瘍組織ではaP2遺伝子は発現していない。既に脂肪細胞特異的な遺伝子発現はシャットオフされているのである。このことから著者らは　ERMSは脂肪細胞がその前駆細胞から脂肪組織に分化する過程で、筋分化へとリプログラムされ、かつ横紋筋への最終分化は起こらずに腫瘍増殖に向かうというモデルを提出している。それではヒトのERMSも脂肪細胞から生ずるのであろうか？　このことを証明することは容易ではない。

昨日の内部セミナーでは、Hatleyの話を聴くことができたので、これに関連する質問をしてみた。ヒトERMSでは様々なdriver mutationsが見られるが、これらの癌遺伝子をaP2依存的に発現させたらマウスはERMSになるのか、という問いである。答えは“No”であった。すなわち脂肪細胞でどんな癌遺伝子を活性化させてもマウスはERMSになるわけではない。今のところ、Sonic Hedgehog pathwayの活性化だけでERMSが作れるということである。ということは、ERMSの起源は必ずしも脂肪細胞だけにとどまるのではない可能性が強い。他の間葉系細胞の可能性も考えておく必要がありそうである。したがって、現段階では“ヒトのERMSは脂肪細胞である“と結論づけるのは時期尚早である。

小児癌は胎児期にその発癌過程が始まることが多く、そのメカニズム研究には制約がある。最近のモデルマウスによる研究は、突破口を開きつつあると思う。結果が次の疑問を生み出すという好ましい循環ができてきているように思う。

10年前とは様変わりである。

（ARMSについては、マウスモデルでは転座の導入だけではARMSはできないので、ヒト腫瘍のゲノム解析から導かれる結論には議論の余地があるが、ARMSの発生プロセスについてはここでは詳述しなかった。

他にも面白いトピックがあったが、未発表のようなのでここで記載することは差し控えることにした。）