ゼブラフィッシュで癌を作ったのは誰か？

 ゼブラフィッシュzebrafish, Danio rerio は脊椎動物で機能している様々な遺伝子を効率よく同定するためのモデルとして登場した。

魚類の実験動物としては1,990年代に出てきたフグpufferfish, Fugu rbripes がある。フグは脊椎動物なので、ヒトを含む哺乳動物の発生と個体維持に関わる大部分の遺伝子を持っていると予想された。しかし総ゲノムサイズが約400 Mbで、ヒトゲノムの約４分の１の大きさである。すなわち非コード領域がたいへん小さいのである。このことから、フグのゲノムの塩基配列をひたすら読んでゆけば、ヒトゲノムを読むよりは効率的に総遺伝子を同定できると考えられたのである。

このプロジェクトを始めたのは後年（2,002年）ノーベル賞を受けたSydney Brennerである。BrennerはすでにC. elegansの実験動物化を達成していたが、この線虫は脊椎動物はおろか、昆虫などの節足動物と比べてもある意味でかなり下等な動物であることがやがて明らかとなった。結局C. elegansは脊椎動物のモデルとしてあまり役に立ちそうにないということになったわけである。そこでフグである。がしかし、関係者の予想に反して当時ヒトゲノムプロジェクトが大変なスピード進行し、2,000年にはそのドラフト版が、さらに2,003年４月にはその完成版が公表されてしまったのであった。結局フグのゲノミクスにおける役目はほとんど自然消滅するという憂き目にあったのだ。

フグのほうに話が逸れてしまったが、ゼブラの研究上のメリットは変異原物質で突然変異を誘発し、その遺伝子座位を決定し、最終的にその現遺伝子を同定する流れが迅速にできるということにあった。特別な手法を用いると、ホモ接合の変異体が簡単に得られるのである。特に身体が透明なので特に造血系の研究には適しているとされている。

私の米国での師匠のTom LookがまだSt. Jude病院にいた頃にゼブラフィッシュの先覚者であるLeonard Zonを講演のために招待した。その折にゼブラについてTomのオフィスで話をしたことがあった。私もその場に呼ばれたので二人のやりとりをそばで聞いていたのだ。そのときTomは“ゼブラで何をするのがふさわしいか？”とLeonardに訊いたのである。Leonardの答えは、“器官形成organogenesisだ。癌はよくない。”と明確に答えたのだ。Tomはそれを聞いたときに、特に表情を変えずに“ふうん”という感じで特別な考えを言わなかったのだ。これが1,999年のことである。

2,003年２月のサイエンスにゼブラフィッシュでMYCでT細胞白血病を作成する論文が発表された (Langenau et al., 2003)。これはDana Farber Cancer Institute (Boston)からの仕事で、責任著者はThomas Lookであった。これがゼブラで作られた最初の癌である。

さて、あのときの二人のやりとりは何だったのだろうか？

Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) に関するメモ

　Alternative Lengthening of Telomeres (ALT)とは、主にヒトがん細胞においてテロメア合成酵素telomeraseを用いることなくテロメアが維持される現象である。（telomeraseを用いないでテロメアを維持する生物種は多数ある。）ALTの性質をもつがんは全体の約5％程度とされる。但し、がんの種類には偏りがあり、良く知られているところでは骨肉腫（osteosarcoma）や膠芽腫（glioblastoma）がある。

　がん細胞がALTを獲得するメカニズムは長らく不明であったが、homology-dependent recombination (HDR)が必要であることは予想されていた。ここ数年間で、ATRX（Alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-linked）遺伝子の失活がALTの成立に必須であることが確定するに至った。

1.　ALTがおこるためにはATRXの変異が必要である。

　最初にALTとATRXとの関連に着目したのはJohns Hopkinsおグループである (1)。膵神経内分泌腫瘍PanNETsではATRXまたはDAXXの変異が高頻度に見られるが、これらの検体についてテロメアの状態をFISHで検出したところ、ATRX/DAXXの変異があるもの（またはATRXのタンパク発現の消失したもの）では強いテロメアシグナルが検出された。強いテロメアシグナル、すなわち長いテロメアはALTの特徴の一つである。ATRXとDAXXは複合体を形成してテロメアのクロマチン構造の維持に関わっているとされていた。ATRXのテロメアへの関与を支持するデータは他にもあり、このことからALT Starr Cancer Concrotium研究グループはALTを示す22細胞株について、ATRX変異またはタンパク発現の消失を調べた (2)。結果はすべての細胞株でATRXの失活が起こっており、このことがALTが引き起こされるのに必要であることが強く示唆された。同時にALTが著しいゲノムの不安定性を伴うことも明らかとなった。

　

2．ALT細胞に対してはATR阻害剤が有効である (3)。

　最近の報告によると、ALT細胞ではテロメアの一本鎖DNA（ssDNA）へのRPAタンパクの結合がS期を過ぎても解消されないことが判明した。RPAにコートされたssDNAはHDRを誘発すると考えられているので、この現象がALTと強く関わっている可能性が考えられた。さらにATR（Ataxia telangiectasia and Rad3 related）を阻害してやるとDNA断裂が起こり細胞死を起こすことがわかった。ATRはDNA複製時の異常によって活性化され、最終的にDNA複製の完遂に関与しているタンパクである。このATR阻害による細胞死はALTを示す細胞に特異的におこる（すなわち低濃度で効く）。ここで問題は、ATR阻害剤の特異性である。DNA損傷、とくに二本鎖断裂によって活性化されるATM（Ataxia telangiectasia mutated）とATRはよく似た分子である。これまで開発されてきたATR阻害剤と称するものはたいていATMも阻害するのが常であった。この研究で用いられているVE-821は最近ひろく使われるようになっている (4)。この化合物はこれまで知られているものよりも特異性が高いと思われる。

　ATM、ATRともこれまでにかなりの研究の蓄積があるが、ATRを阻害したときの大きな問題点は、正常細胞でATRが阻害された場合、細胞死が見られることである。したがって、がん細胞を標的としたATRの阻害は重篤な副作用がおこることが予想される。この論文ではALT細胞に特異的に効くということなので、その濃度では正常細胞に対してはさほどの毒性はみられないだろう。

　臨床試験の進展が期待される。

３．さらなる疑問？

　少数のALT細胞株ではATRX遺伝子の変異が見られない。したがって、これらの細胞ではATRXの失活を介さない経路でALTが成立していると思われる。この経路は何か？

　ATRX変異が直ちにALTを促すわけではない。培養系でも実際にALTの性質を示すためには時間を要するのである。したがって、別の遺伝子の変異が必要だと思われる。この（これら）の遺伝子は何か？

追記

　Ronald DePinhoのグループが作成したテロメアRNAのノックアウトマウスをホモ同士で交配してゆくと、やがてテロメアの短縮化が進み、5-6世代頃になると個体レベルで老化のフェノタイプが発現してしまう (5)。ここにp53 nullアリルがホモまたはヘテロで入っていると上皮性の腫瘍である癌腫が多発する。ふつうマウスで好発する腫瘍は肉腫（間葉系由来）が多いので、ここで初めてマウスでのヒトの癌腫のモデルができたことになる。これは画期的な業績と思われた。私はこのようなテロメア活性がないマウスに生じた腫瘍はすべてALTによるテロメア複製能を獲得しているものと理解していた。このマウスで起きる現象は、ヒトにおけるALTが肉腫に好発するのと対照的なので、興味深い現象であると考えていた。あるときALTで重要な発見を続けているRoger Reddel (University of Sydney)と話をしていたときに、このマウスの話が出た。彼はこのマウスの腫瘍は必ずしもALTによるものとは限らないと言っていた。話はそこで中断してしまった。このマウスの腫瘍（癌腫）はどうやってテロメアを維持しているのだろうか？

1.http://www.sciencemag.org/content/333/6041/425.long

2.http://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1002772

3.http://www.sciencemag.org/content/347/6219/273.long

4.http://www.nature.com/nchembio/journal/v7/n7/full/nchembio.573.html

5.http://www.nature.com/nature/journal/v406/n6796/full/406641a0.html

がんの免疫療法再び：延命から完治へ

　今年初めに出たCellのLeading Edge Selectという項目に僅か2ページであるが、重要な記事が出ている [Monteiro, 2,015]。がんの免疫療法は概念的には新しいものではないが、最近の試みは免疫チェックポイント分子（ここではCTLA-4とPD-1）に対する抗体を投与することによってこれを抑制し、がん細胞に対する免疫を活性化することでがん細胞を殺そうとするものである。昨年（2,014年）は、この方法を用いたがん治療の成功例の論文が爆発的に出てきた年であった。中村祐輔（現シカゴ大学）はこの分野の先頭にいる日本人である。彼のブログ“中村祐輔のシカゴ便り”にその様子が書かれている。免疫療法の現状を知りたい方には中村ブログを読むことをお勧めする。
　この免疫療法の適用範囲、すなわち効くがんの種類のリストはどんどん長くなっている。ざっと挙げると、転移性黒色腫、非小細胞性肺がん、腎がん、尿路上皮性膀胱がん、といった種類のがんである。免疫療法における最大の疑問はなぜ特定の患者にしか効果がないのかということである。この治療効果を決定する因子を探ることによって免疫療法の効果を多くの患者に拡げることができると思われる。腫瘍組織中におけるcytotoxic T cellの数が重要であることはわかっている。もしがん細胞のゲノムが多数の突然変異をもっていれば、効果が高いことも判っている。このような細胞は腫瘍特異的抗原をより多く発現しているので免疫細胞に認識されやすいのである。但し、多数の変異を持つがん細胞でも治療効果が低いケースも見られる。現在はどのネオエピトープがT細胞の反応を惹起するかということに関心が集まっている。多数の腫瘍特異抗原のうち、ごく一部のものが有効であることも判明した。
　これらの研究成果から、今後は免疫反応を引き起こす腫瘍特異的抗原を探索すること、それらが個々の患者のがん細胞にあるかどうかをエクソムシークエンシングで調べること、およびこれらの有効な抗原をワクチンとして患者の免疫系を活性化すること、等が研究の方向となると思われる。
　このように書くと良いことづくめのようだが、もともと免疫チェックポイントは免疫系の暴走を防ぐために備わっている。したがってこれを抑制することは自己免疫を引き起こすことになる。この療法の大きな障害は重篤な副作用である。これらの問題も含めて、中村祐輔ブログを読むことをお勧めする。

追記
　Cancer immunotherapyの歴史を10分で知りたい方はこちらを。

横紋筋肉腫の細胞起源の謎

横紋筋肉腫 Rhabdomyosarocoma（RMS）の話である。

この腫瘍は発生頻度は高くないものの（米国では約350例/年）、予後の悪い小児腫瘍として知られている。この腫瘍には組織学的特徴から二つのグループがあり、一つは胞巣型（Alverolar Rhabdomyosarcoma, ARMS, 35%）もう一つは胎児型（Embryonal Rhabdomyosarcoma, ERMS, 65%）である。RMSの名称の由来は組織所見と横紋筋の発生を司る遺伝子群（MyoD1, myogenin等）が発現しているからである。概してARMのほうが悪性である。

ARMSとERMSとは上のような共通した性質をもつが、これらは異なる腫瘍であると考えられている。最近のゲノム配列決定の結果、ゲノム不安定性においてこれら二つの型は著しく異なっているとこが判明した（尤もこれは以前から核型等から予想されていたことではあるが）。ARMSではPAX3/FOXO1やPAX7/FOXO1などの特徴的な相互転座が見られる。これに対して、ERMSでは特徴的な相互転座はなく、核型はより複雑である。実際両者のゲノム変異の率には大きな差があり、ARMS（転座＋）では6.4 (per cell)、ERMS（転座−）では17.8である [Shern et al., 2014]。

注目するべきは、ARMSではPAX遺伝子の相互転座以外にはこれといった変異は認められず、転座タンパクの生成のみで腫瘍発生が説明できる。一方ERMSでは、かなり広範な遺伝子の変異がみられることから、何らかの原因でゲノム不安定性が生じた結果、患者ごとに異なるdriver変異を獲得したものと解釈される。この両者の違いは、ゲノム異常の少ない小児腫瘍型（ARMS）と、異常の多い成人腫瘍型（ERMS）ということができる。

横紋筋肉腫の起源であるが、その発生部位が横紋筋とは異なる解剖的部位であることから、横紋筋の前駆細胞とは異なる可能性が議論されてきた。この点で、Hatleyらの仕事は興味深い (Hatley et al., 2012)。著者のうちの一人（Graff）は脂肪組織の発生を解析することを目的として、aP2遺伝子プロモーター依存的なSmo^M2の発現が起こるマウスを作成した。その結果、100%のマウスにERMSが生じた。Graffは発癌には興味がなかったから、Hatleyがこのマウスを引き継いでその後の解析したのである。

この実験結果からから、少なくともマウスでは脂肪細胞adipocyteがERMSの（少なくと一つの）母細胞であることが示された。しかしながら、診断可能なマウスの腫瘍組織ではaP2遺伝子は発現していない。既に脂肪細胞特異的な遺伝子発現はシャットオフされているのである。このことから著者らは　ERMSは脂肪細胞がその前駆細胞から脂肪組織に分化する過程で、筋分化へとリプログラムされ、かつ横紋筋への最終分化は起こらずに腫瘍増殖に向かうというモデルを提出している。それではヒトのERMSも脂肪細胞から生ずるのであろうか？　このことを証明することは容易ではない。

昨日の内部セミナーでは、Hatleyの話を聴くことができたので、これに関連する質問をしてみた。ヒトERMSでは様々なdriver mutationsが見られるが、これらの癌遺伝子をaP2依存的に発現させたらマウスはERMSになるのか、という問いである。答えは“No”であった。すなわち脂肪細胞でどんな癌遺伝子を活性化させてもマウスはERMSになるわけではない。今のところ、Sonic Hedgehog pathwayの活性化だけでERMSが作れるということである。ということは、ERMSの起源は必ずしも脂肪細胞だけにとどまるのではない可能性が強い。他の間葉系細胞の可能性も考えておく必要がありそうである。したがって、現段階では“ヒトのERMSは脂肪細胞である“と結論づけるのは時期尚早である。

小児癌は胎児期にその発癌過程が始まることが多く、そのメカニズム研究には制約がある。最近のモデルマウスによる研究は、突破口を開きつつあると思う。結果が次の疑問を生み出すという好ましい循環ができてきているように思う。

10年前とは様変わりである。

（ARMSについては、マウスモデルでは転座の導入だけではARMSはできないので、ヒト腫瘍のゲノム解析から導かれる結論には議論の余地があるが、ARMSの発生プロセスについてはここでは詳述しなかった。

他にも面白いトピックがあったが、未発表のようなのでここで記載することは差し控えることにした。）